CBA法多細胞因子檢測的關鍵-表面活性基團數

 流式熒光檢測技術又叫液相懸浮芯片技術，自誕生以來，由于其靈敏而準確的光學編碼鑒別、快速的反應動力學、靈活的檢測項目組合、可實現定量分析以及同時適用于蛋白與核酸分子檢測等特點而成為多重指標聯合檢測的技術平臺。

  熒光編碼微球是該項技術的靈魂，它不僅僅影響待檢測物的重數，檢測試劑的穩定性，其表面活性基團的數量（用于連接抗原或核酸）更是直接影響檢測的靈敏度和準確度。因此在考慮一種熒光編碼微球適不適合做流式熒光法檢測試劑盒的原料時，其表面活性基團是個非常重要的指標。

圖1 熒光編碼微球的重要參數

  目前市面上大部分熒光編碼微球表面采用羧基修飾，廠家一般也會給出他們生產的微球表面的羧基量，一般通過滴定測得，單位為µeq/g。如圖2，顯示了碧芯生物3μm球的表面滴定數據。一般而言，微球的粒徑越小，比表面積就越大（與粒徑的平方成反比），此時達到相同的羧基密度，小粒徑的微球的表面滴定數據就會越大。對于相同粒徑的熒光編碼微球，表面滴定數據越大說明表面羧基密度越高。

圖2  碧芯生物3μm球的表面滴定數據

然而在實際樣本的檢測中，表面羧基滴定數據僅能作為參考，卻并不能直接反映表面偶聯抗體密度。例如，我們并不知道當表面的羧基滴定度達到多少時，我們可以將捕獲抗體滿滿的結合在微球表面；此外，當與其他活性基團修飾的熒光編碼微球比較時（比如與表面親和素修飾的微球比較時），表面多少的羧基量的球與表面多少親和素量的微球能結合同樣多的捕獲抗體呢？因此，僅得知羧基修飾的熒光編碼微球表面羧基量來判斷其是否可作為流式熒光法檢測試劑盒的原料是遠遠不夠的，只有直接測定微球結合捕獲抗體后微球表面的抗體密度，甚至計算出平均每個熒光編碼微球上能結合抗體的最大數量，才能真正直觀反映微球的品質。然而，想要直接測定微球表面能結合的捕獲抗體的量比較困難。有人采用間接法，也就是先將已知濃度且過量的抗體偶聯到已知數量的熒光編碼微球，分離微球后通過測定溶液中殘余的抗體量來測定微球表面的抗體結合量。這種方法由于采用間接法，分離時溶液中的抗體損失都會計算成微球所結合的抗體，且測定溶液中抗體殘余的檢測一般采用顯色法，該方法的靈敏度較差，因此該方法測到的數據不夠準確。此外，該方法相對繁瑣，如果作為質量控制的方法，不夠便捷。

    面對這一問題，碧芯公司也經過反復的思考和大量的研究摸索，建立了能準確測定熒光編碼微球表面能結合的最大抗體量的方法。如圖3所示，我們采用藻紅蛋白替代抗體，將藻紅蛋白偶聯到熒光編碼微球表面后，采用流式細胞儀測定微球表面的藻紅蛋白熒光信號（模擬表面捕獲抗體）。藻紅蛋白偶聯的量越多，熒光越強，從而構建PE的熒光強度與PE偶聯量的相關性。計算出微球表面的藻紅蛋白數量。由于該方法采用直接測定微球表面的藻紅蛋白熒光信號，因此更能準確反映微球表面結合藻紅蛋白的數量。

圖3 基于藻紅蛋白的微球偶聯抗體容量評價方法的建立

表1 碧芯生物Beadstar-mPlex®系列光編碼微球表面PE偶聯密度檢測結果

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Beadstar-mPlex®磁性熒光編碼微球共計3種尺寸，每種尺寸微球可編碼30-70重熒光。表面修飾集團包括：Avidin、氨基、羧基。具體參數如下表所示：