在流式檢測中為什么低吸附磁性熒光編碼微球的檢測效果會更好

流式熒光技術又稱懸浮陣列、液相芯片等，是近年來逐漸發展起來的多指標聯合診斷技術。該技術以熒光編碼微球為核心，集流式原理、激光分析、高速數字信號處理等多種技術于一體，多指標并行分析。該項技術其不僅擁有化學發光高靈敏度、高精密度的優勢，同時還具備高通量、快速、并行檢測等特點，既可適用于臨床檢驗也適用于科研，而且檢測時對樣本需求量極少，特別適合一些珍貴樣本的多指標分析。此外，平臺具有良好的開放性和拓展性，用戶可根據自己的需求來設計和實現對不同目標分子的聯合檢測。

盡管流式熒光技術能同時檢測多種抗原，但在研發中可能會遇到一種情況：采用流式熒光法檢測單一或少數幾種指標能實現高靈敏檢測，然而當指標數進一步增加時，原本某一個本來靈敏度很高的指標可能會出現目標抗原濃度為0的標樣的檢測熒光值突然升高而導致靈敏度顯著下降的情況。以下是我們在開發多細胞因子檢測試劑時遇到的一個真實的例子：圖1（a）為我們構建一個9個細胞因子聯檢時做標曲，其中的TNF-a的標準曲線。從結果中可知即使當抗原濃度低至3.4 pg/mL也在標準曲線線性范圍內。此時，我們再增加一個細胞因子（共10因子），此時，再對TNF-α驗證標準曲線時，會發現TNF-α濃度為零的標樣熒光檢測值顯著升高（MFI從原來的142增加至984，相同的儀器，同樣的測試條件），隨之而來的是標曲的線性范圍覆蓋下限明顯不足（b）。

                         圖1 （a）9因子檢測時TNF-α的標曲；（b）增加到10因子檢測時TNF-α的標曲

  當然，這是一個比較特別的例子，不一定在所有的實驗中都會出現這樣急劇增高的現象。然而，我們還是經常會遇到隨著檢測目標抗原種數的增加，抗原濃度為0的標樣中檢測熒光值會逐漸升高的情況，只是升高得沒那么顯著。

  接下來，讓我們來思考一下，為什么隨著檢測目標抗原種數的增加，個體微球群在標準品濃度為0時的標樣檢測熒光值會增加呢？不難想到，這個主要是由于微球與熒光檢測抗體間發生非特異性吸附導致的（我們把這種由于微球和熒光檢測抗體通過非特異性吸附產生的熒光增值叫做噪音，示意圖如圖2）。隨著聯檢項目的增加，熒光檢測抗體的種數也會隨之增加，故而通過非特異性吸附，結合到個體微球群的熒光檢測抗體也會增加，也就是噪音也會增加。

                                                  圖2 微球上的噪聲示意圖

     這種情況對一些要求靈敏度較高的檢測項目明顯是不利的。此外，由于熒光檢測抗體與個體微球群之間的吸附是一種比較弱的結合力，容易受到多種因素的影響而產生波動。因此，當用于血清樣本檢測時，血清中存在的各種蛋白質會與熒光檢測抗體競爭微球的非特異性吸附位點，最終的結果是導致檢測到的熒光信號不能正確的對應血清中各抗原的濃度，這種影響在含低濃度抗原的血清中尤為明顯。以細胞因子檢測試劑盒為例，我們會發現對一些正常人血清進行細胞因子檢測時，很大概率會出現熒光檢測值低于對照品為0的標樣，從而算不出細胞因子的濃度（圖3為細胞因子檢測出現負值的原因分析示意圖3）。從我們掌握的數據來看，即使是一些主流的進口多細胞因子試劑，對正常人血清各個因子的檢測率不到50%。

圖3 在噪音高時，低值血清樣本檢測熒光值出現負值的原因分析示意圖

    有沒有好的方法去降低噪音呢？針對這個問題，碧芯生物科技開發出低吸附磁性熒光編碼微球，這種微球經過特殊的工藝處理，對熒光檢測抗體的非特異性吸附非常低。那么如果采用這種微球做試劑，圖1所出現的問題能否得到解決呢？接下來我們又做了實驗，用低吸附磁性熒光編碼微球替代圖1中使用的普通磁性熒光編碼微球，同樣做成10因子檢測試劑盒，我們驚喜的發現，TNF-α微球群噪音值得到明顯的改善，由原來的844降低到6，與之對應的是標準曲線覆蓋的濃度范圍又可以低至3.4 pg/mL了

   最后我們對比了采用低吸附微球構建的12細胞因子檢測試劑與進口七因子檢測試劑在噪聲方面的差異，如圖所示，采用碧芯生物生產的低吸附磁性熒光微球生產的12細胞因子檢測試劑的噪聲不到進口同類試劑的5%（圖5）。通過降低噪音，碧芯生物12因子檢測試劑顯著提升了各個細胞因子對于正常血清的檢出率，各因子檢出率均高于90%。

                                     圖5碧芯生物試劑與某進口th1/th2/th7七因子檢測試劑噪聲對比